Les protéines recombinantes
Nous avons vu comment cloner un gène, l'isoler, l'amplifier et l'introduire dans une cellule hôte par transformation. Cependant, le clonage peut n'être qu'une étape intermédiaire et l'objectif final est alors de produire la protéine codée par le gène cloné (protéine recombinante).
Sont présentés ici les systèmes d'expression, les stratégies de régulation et les méthodes de purification et d'analyse des protéines recombinantes.
Protéine recombinante
Une protéine recombinante est une protéine produite par une cellule hôte (bactérie, levure, cellule animale) à partir d'un gène cloné et introduit artificiellement dans cette cellule.
L'expression de protéines recombinantes repose sur l'utilisation de la machinerie cellulaire de l'organisme hôte pour assurer :
- la transcription du gène cloné en ARN messager,
- la traduction de cet ARN en protéine
La production d'une protéine recombinante se fait donc en étapes successives:
- clonage du gène d'intérêt dans un vecteur d'expression,
- introduction du vecteur dans une cellule hôte (transformation ou transfection)
- expression du gène par la cellule hôte conduisant à la production et l'accumulation de la protéine recombinante.
Les deux premières étapes ont été abordées dans les chapitres précédents. Nous allons voir les systèmes d'expression.
Les systèmes d'expression
Le choix du système d'expression conditionne:
- la quantité de la protéine produite,
- sa qualité
- sa fonctionnalité
Ce choix dépend de plusieurs paramètres:
- l'origine biologique de la protéine (procaryote ou eucaryote),
- la taille et la complexité structurale de la protéine,
- la nécessité de modifications post-traductionnelles (glycosylation, ponts disulfures)
- le rendement attendu,
- les contraintes techniques et économiques.
Expression dans E.coli
Le système d'expression dans E.coli est le plus utilisé en raison de:
- sa simplicité,
- sa rapidité
- son faible coût.
- sa facilité de manipulation
Il est particulièrement adapté à l'expression:
- de protéines procaryotes
- ou de protéines eucaryotes simples.
Limites: E.coli ne réalise pas certaines modifications post-traductionnelles. De plus, des problèmes de repliement peuvent conduire à la formation de corps d'inclusion, constitués de protéines insolubles.
Expression chez les levures
Les levures sont des eucaryotes unicellulaires qui représentent un compromis entre bactéries et cellules eucaryotes supérieures.
Elles permettent:
- certaines modifications post-traductionnelles
- une culture relativement simples et peu coûteuse.
Expression dans des cellules d'insectes et de mammifères
Les cellules d'insectes ou de mammifères sont utilisés lorsque la protéine recombinante nécessite des modifications post-traductionnelles complexes et spécifiques.
Ces systèmes sont:
- plus coûteux
- techniquement plus exigeants,
mais ils permettent une expression fidèle de protéines eucaryotes complexes.
Le vecteur d'expression
Contrairement à un vecteur de clonage, un vecteur d'expression permet, non seulement la multiplication de l'ADN, mais aussi sa transcription et sa traduction.
Ce vecteur contient généralement:
- des signaux de transcription adaptés à l'hôte (promoteur, terminateur)
- une région d'initiation de la traduction,
- des éléments de régulation de l'expression,
- un gène de sélection,
- le gène d'intérêt cloné.
Pour être fonctionnel le gène doit:
- être inséré dans le bon sens,
- respecter son cadre de lecture,
- et bien sûr être complet.
Ces paramètres sont vérifiés par analyse de la séquence.
Régulation de l'expression
Il est essentiel de contrôler le moment et le niveau d'expression de la protéine recombinante afin d'éviter:
- une toxicité pour la cellule hôte,
- une surcharge métabolique,
- un faible rendement.
Expression constitutive
Dans un système constitutif, le gène cloné est exprimé en continu, dès que la cellule hôte se multiplie.
Cette stratégie peut entrainer :
- une perturbation de la croissance cellulaire,
- une diminution du rendement global.
Expression inductible
Dans un système inductible, le gène d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible. L'expression est déclenchée par ajout d'un inducteur.
Un exemple classique est le système IPTG/opéron lactose chez E.coli. L'IPTG est un analogue non métabolisable du lactose.
Ce type de régulation permet :
- d'optimiser la production,
- d'améliorer le rendement,
- de lmiter la toxicité.
Optimisation de l'expression
L'expression efficace d'une protéine recombinante nécessite souvent une optimisation des conditions expérimentales :
- la température d'expression,
- la durée et l'intensité de l'induction,
- la composition du milieu de culture,
- le stade de croissance.
Par exemple, l'expression à basse température peut améliorer la solubilité des protéines produites. La fusion avec des protéines partenaires peut:
- favoriser le repliement,
- augmenter le rendement,
- faciliter la purification.
Purification des protéines recombinantes
La purification des protéines recombinantes est facilitée par l'ajout d'un tag d'affinité à la protéine d'intérêt, qui permet une chromatographie spécifique.
Exemples de Tag :
- His-tag (enchainement d'histidines) qui interagit avec des ions métalliques (Ni2+, Co2+)
- GST (Glutathion S-tranferase) qui a une affinité pour le glutathion.
- MBP (Maltose Binding Protein) qui a de l'affinité pour le maltose.
Chromatographies d'affinité
La purification par chromatographie d'affinité repose sur trois étapes :
- la fixation de la protéine taguée sur une matrice spécifique,
- l'élimination des protéines non spécifiques par lavage,
- l'élution de la protéine recombinante.
D'autres chromatographie de purification sont possibles comme :
- la chromatographie échangeuse d'ions,
- la chromatographie d'exclusion.
Le degré de pureté de la protéine exigé va dépendre de l'application qui en sera faite (recherche, usage médicale ou industriel)
Analyse des protéines recombinantes
Une fois purifiée, la pureté et la taille apparente de la protéine recombinante sont analysées.
- Par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) suivie d'une coloration des protéines. La présence d'une bande majoritaire à la taille attendue indique une purification efficace.
- Par Western blot, où les protéines sont transféré sur membrane après migration sur gel et détectée par un anticorps spécifique.
Applications des protéines recombinantes
Les protéines recombinantes sont utilisée dans de nombreux domaines:
- en recherche fondamentale, elles permettent
- l'étudier la fonction d'un gène,
- d'analyser les interactions protéiques.
Les protéines recombinantes constituent un outil central en biologie moléculaire.
- en biotechnologie médicale, la production :
- d'enzyme,
- d'hormones (insuline)
- vaccins,
- anticorps thérapeutiques.
Les protéines recombinantes sont largement utilisées en médecine et en industrie.
- en thérapie génique, où l'insertion d'un gène fonctionnel permet de corriger une mutation responsable d'une maladie. Dans le cas de :
- maladies génétiques
- certaines pathologies hématologiques
- recherche en oncologie.
Dans ce cas ce sont des vecteurs viraux qui sont le plus souvent utilisés pour transférer le gène.
- en biotechnologies industrielles, pour la production
- d'enzymes utilisées dans l'agroalimentaire,
- des détergents de la chimie verte.
Ces procédés sont plus sûrs, plus efficaces et plus respectueux de l'environnement.
