PCR
La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une technique mise au point en 1985 par Karry Mullis. Elle permet d'amplifier in vitro une région ciblée d'ADN à partir d'une quantité initiale très faible.
Un document sur la PCR existe sur le site RNBio que vous pouvez consulter en cliquant ici.
Dans le cadre du clonage d'ADN, la PCR constitue une alternative ou un complément au clonage classique. En effet, elle permet d'obtenir rapidement de grandes quantités d'un fragment d'ADN sans passer par une étape de propagation dans une cellule hôte.
En laboratoire de biologie moléculaire, la PCR est fréquemment utilisée pour
- amplifier un gène avant clonage,
- introduire des sites de restriction,
- réaliser des mutations dirigées,
- cribler des clones bactérien.
La PCR permet l'amplification exponentielle d'une région ciblée d'un ADN double brin.
Elle repose sur la répétition cyclique d'une série de réactions de réplication. Les produits obtenus à la fin d'un cycle (amplicons) servent de matrices pour le cycle suivant, ainsi, le nombre de copies double (théoriquement) à chaque cycle.
La PCR est réalisée dans un appareil programmable (thermocycleur) qui permet de contrôler :
- les températures
- la durée de chaque étape,
- le nombre de cycles,
- la vitesse de changement de température.
la réaction de PCR en animation
Les 3 étapes d'un cycle de PCR
Chaque cycle de PCR comprend 3 étapes successives.
1- Dénaturation de l’ADN
La dénaturation de l'ADN consiste à séparer les deux brins d'ADN double brin.
- Température : 94-95°C
- Durée : environ 30 sec
A l'issue de cette étape, l'ADN simple brin peut servir de matrice.
2- Hybridation des amorces (annealing)
Des oligonucléotides (amorces) s'hybrident spécifiquement aux extrémités de la séquence à amplifier.
- Température : Ta (annealing), calculée à partir du Tm des amorces
- Durée : environ 30 sec
Cette étape détermine la spécificité de l'amplification.
3- Polymérisation (élongation)
Une ADN polymérase thermorésistante synthétise le brin complémentaire (sens 5'-3') à partir de l'extrémités 3'-0H libre des amorces.
- Température : 72°C *
- Durée : dépend de la vitesse de synthèse de la polymérase et de la longueur du fragment à amplifier.
A la fin du cycle, l'ADN est de nouveau sous forme double brin.
(*) Remarque sur la température de polymérisation
Certaines ADN polymérase utilisées pour la PCR ont été modifiées pour fonctionner à des températures inférieures à 72°C (qui est la température optimum pour la Taq pol). Il est alors possible de ne faire qu'une seule étape hybridation/polymérisation et de gagner du temps sur les temps de changement de température.
Le mélange réactionnel
L'amplification par PCR est importante (en théorie on peut obtenir 230 copies après 30 cycles, à partir d'1 fragment d'ADN), donc tous les comosants doivent être présents en quantité suffisante.
ADN matrice
L'ADN matrice contient la séquence cible à amplifier.
En théorie, une seule molécule est suffisante pour la PCR, mais en pratique une quantité minimale est nécessaire pour assurer une amplification efficace.
Amorces
Deux amorces sont nécessaires, elles :
- délimitent la région à amplifier
- servent d'amorces en fournissant les extrémités 3'-OH indispensable à l'ADN polymérase
Elles mesurent en général entre 18 à 30 nucléotides.
Les dNTP
Les 4 dNTP (dATP, dTTP, dGTP et dCTP) sont les précurseurs de la synthèse d'ADN.
L'ADN polymérase
Les polymérases utilisées en PCR doivent être thermorésistantes.
La plus courante est la Taq polymerase, issue de Thermus aquaticus.
Tampon de réaction
Le tampon assure
- un pH optimal
- La présence de cations bivalents (Mg2+) cofacteurs indispensables de l'ADN polylmérase,
- Une force ionique adaptée à la stabilité des hybrides ADN/ADN.
Les amorces
Le choix des amorces est déterminant lors de la mise au point d'une PCR. Elles jouent un double rôle:
- en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape d'hybridation)
- elles servent d'amorce à la synthèse d'ADN (étape de polymérisation).
La séquence des amorces est déterminée à partir de la séquence des extrémités de la région ADN à amplifier.
Les amorces doivent :
- avoir des températures de fusion (Tm) proches (car les deux amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions).
- ne pas être complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
- ne pas former de structures secondaires.
- présenter à minima une extrémité 3' hautement spécifique.
Les amorces sont synthétisées chimiquement et possèdent une extrémité 5'-OH. Ainsi, les fragments d'ADN obtenus après PCR ne sont pas phosphorylés en 5'.
Température d'hybridation (Ta)
La température d’hybridation (Ta) conditionne la stabilité des duplex (amorce/ADN matrice).
Cette température Ta est calculée à partir de la température de fusion Tm :
Ta = Tm-5°C
Il est possible de calculer le Tm connaissant la séquences de l'amorce :
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Rappel : Le Tm est la température pour laquelle 50% de l'ADN est dénaturé. En choisissant une Ta inférieure, au Tm on favorise l'hybridation spécifique des amorces.
Une Ta trop basse favorise les hybridation non spécifiques.
Une Ta trop élevée empêche une hybridation stable et diminue l'efficacité de la PCR.
Optimisation et limites de la PCR
Nombre de cycles
Au cours des cycles plusieurs paramètres évoluent :
En début d’expérience
- excès d’oligonucléotides amorces et de dNTP,
- faible concentration en ADN,
- La limitation principale est la probabilité de rencontre amorce/matrice.
Au cours de la PCR
- accumulation de copies d’ADN
- augmentation de la viscosité du milieu réactionnel (ADN),
- diminution des amorces et des dNTP,
- libération de pyrophosphate qui, en concentration élevée, inhibent la polymérase.
Ces phénomènes conduisent progressivement à un plateau d'amplification.
C'est pourquoi le nombre de cycles est généralement limité à environ 30 cycles.
Fidélité enzymatique
La Taq polymerase, qui est la plus couramment utilisée, n'a pas d'activité correctrice (exo 3'-5'), ce qui entraine un taux d'erreur relativement élevé.
Pour des applications qui nécessitent une meilleure fidélité (clonage, expression de protéines), on utilise des polymérases à haute fidélité qui possèdent une activité de relecture comme la Pfu, Phusion ou Q5.
