Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
Comme pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, la migration en électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) repose sur le déplacement des molécules chargées sous l’effet d’un champ électrique.
Cependant, la PAGE offre une résolution beaucoup plus élevée, en particulier pour les petites molécules (ADN/ARN courts, protéines), en effet:
- le gel de polyacrylamide a une structure plus homogène et plus fine que le gel d’agarose,
- les pores du gel sont plus petits et mieux contrôlés, permettant une meilleure séparation des molécules de taille proche.
La migration sur PAGE peut être réalisé en conditions natives ou en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Les paramètres de séparation sont alors différents.
En conditions natives, la séparation dépend de:
- la taille
- la charge
- la conformation des molécules
En conditions dénaturantes, SDS-PAGE, les protéines sont dénaturées car recouvertes de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) qui leur confère une charge négative proportionnelle à leur masse. La séparation dépend alors uniquement de la masse moléculaire, ce qui simplifie l'interprétation.
Séparation dans le gel de polyacrylamide
Le gel de polyacrylamide est un réseau poreux formé par polymérisation de deux composés :
- Acrylamide: monomère de base.
- Bis-acrylamide: agent réticulant formant des ponts entre els chaînes d’acrylamide.
La taille des pores du gel est déterminée par :
- La concentration totale en acrylamide (exprimée en %).
- Le rapport acrylamide/bis-acrylamide (généralement 29:1 ou 37,5:1).
Concentration en acrylamide et applications
| Concentration acrylamide |
Application principale |
| 5% | Protéines de masse moléculaire élevée (>100 kDa) |
| 8 à 10% | Protéines de masse moléculaire intermédiaire (40-100 kDa) |
| 12% | Protéines de masse moléculaire moyenne (20 à 80 kDa) |
| 15% | Petites protéines (10 à 50 kDa) |
| 20% | Très petites protéines ou ADN:ARN courts (<1000 pb) |
Tampon de migration
Pour les acides nucléiques: le tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) est utilisé, comme en agarose, mais souvent à une concentration plus élevée pour une meilleure conductivité.
Pour les protéines: le tampon Tris-Glycine-SDS (pH 8,3–8,8) maintient les protéines dénaturées et chargées négativement.
Protocole expérimental (exemple : SDS-PAGE)
Préparation du gel
Le gel PAGE est coulé dans un bloc vertical qui est en deux parties.
- Le gel supérieur, le premier qui est tranversé par les molécules, est le gel de concentration (stacking gel) (pH 6,8 à faible concentration 4%) permet d'aligner les protéines en une bande fine.
- Le gel inférieur est le gel de séparation (resolving gel) (pH 8,8 à concentration adaptée) permet la séparation selon la masse des protéines.
Préparation des échantillons
Les protéines sont dénaturées en les incubant à 90-95°C dans un mélange:
- SDS: dénature et charge négativement les protéines
- ß-mercaptoéthanol ou DTT (Dithiothreitol): rupture des ponts disulfure
Migration
Les échantillons sont déposés dans les puits du gel de concentration (gel vertical).
La migration se fait à 100–150 V jusqu’à ce que le front de migration (bleu de bromophénol) atteigne le bas du gel.
Visualisation
Il existe plusieurs méthodes de visualisation selon la sensibilité souhaitée.
- Bleu de Coomassie: simple et rapide avec une sensibilité moyenne
- Argent est très sensible
- Colorants fluorescents qui permet une qunatification précise
Le transfert du gel sur une membrane est réalisé pour un Western Blot.
Analyse des résultats
l'estimation de la masse moléculaire est réalisé à l'aide d'un marqueur de masse moléculaire (ladder). Elle peut être réalisé visuellement ou reportée sur une gamme étalon où la distance de migration est inversement proportionelle au logarithme de la masse moléculaire.
Quantification
L’analyse à l'oeil nu ou par densitométrie (logiciels d’analyse d’image) permet la comparaisons entre échantillons et une estimation relative des quantité. Cette méthode est peu précise.
