Stabilité et dénaturation de l'ADN
La stabilité de l'ADN désigne sa capacité à conserver sa structure sous forme double brin intacte malgré les agressions environnementales physiques, chimiques ou biologiques.
Les facteurs de stabilité
La stabilité de l'ADN double brin est la somme d'un ensemble de facteurs intrinsèques:
- Les liaisons hydrogène entre les des deux brins au niveau des bases complémentaires.
- L'empilement des bases avec des interactions hydrophobes entre les bases ainsi que des forces de Van der Waals entre les bases empilées.
- Les interactions électrostatiques entre les groupes phosphates chargés négativement des deux brins.
- La compaction de l'ADN avec le super-enroulement de l'ADN chez les procaryotes et la condensation de la chromatine chez les eucaryotes qui protège l'ADN des cassures et dénaturations.
L'ensemble de ces interactions contribuent à la stabilité de la structure en double hélice de l'ADN, mais elles sont aussi sensibles aux variations de température, de pH de la concentration en ions (Mg2+ et Na+).
Effet du pH
In vivo, le pH est stabilisé généralement autour du pH 7,4 (pH physiologique). Il est donc important, in vitro, de maintenir ce pH autours de cette valeur avec des solutions tamponnées.
Des pH extrêmes modifient les charges au niveau des bases et entraînent la dénaturation et des mutations chimiques (par exemple, la désamination de la cytosine (C) en uracile (U)).
Effet de la température
Effet hyperchrome
Sous l'effet d'une augmentation de la température, il y a séparation des 2 brins (dénaturation), on parle aussi de fusion de l'ADN.
Il est possible de suivre ce changement d'état «en direct» en mesurant la variation de l'absorbance à 260nm au cours de l'augmentation de température.
En effet, l'ADN simple brin absorbe 12 à 14% de lumière en plus par rapport à l'ADN double brin à 260nm. Cette différence d'absorbance est dûe à la plus grande stabilité des bases quand elles sont «empilées» dans la double hélice. En passant de la structure double brin à simple brin, les bases sont moins stables donc plus facilement excitables.
Tm : Température de fusion
La température de fusion ou de demi-dénaturation (Tm) est une température caractéristique à laquelle 50 % des liaisons hydrogènes sont rompues. A Tm, 50% de l'ADN est dénaturé.
Facteurs de stabilité
Plus l'ADN est stable, plus la Tm est élevée.
Le Tm augmente avec:
- le pourcentage en bases GC.
- En effet, plus le pourcentage en Guanine et Cytosine est élevé, plus le nombre de liaisons hydrogène est élevé, plus la double hélice d'ADN est stable.
- la concentration en sels dans le tampon.
- Les cations (Na⁺, K⁺, Mg²⁺) jouent un rôle clé dans la stabilisation de la double hélice d'ADN en neutralisant les charges négatives des groupements phosphates de l'ADN.
Dénaturation/Renaturation - Hybridation
Le processus de dénaturation/renaturation est réversible. Ce processus permet l'hybridation de courtes séquences sur une matrice ADN simple brin comme les amorces en PCR, ou comme les sondes marquées en Southern blot.
